Vì các daimyo ngày càng hận thù lẫn nhau vì quyền lực trong cuộc chiến tranh Ōnin, lòng trung thành ngày càng mai một, cho đến khi nổ ra chiến tranh vào cuối thời kỳ Muromachi, hay còn gọi là thời kỳ Sengoku.

Khi Shogun Ashikaga có ảnh hưởng cuối cùng Yoshiteru bị ám sát năm 1565, một daimyo giàu tham vọng, Oda Nobunaga, nắm lấy cơ hội và lập anh trai của Yoshiteru là Ashikaga Yoshiaki làm Shogun Ashikaga thứ 15. Tuy nhiên, Yoshiaki chỉ là một Shogun bù nhìn.

Mạc phủ Ashikaga cuối cùng cũng chấm dứt năm 1573 khi Nobunaga đưa Ashikaga Yoshiaki ra khỏi Kyoto. Ban đầu, Yoshiaki chạy đến Shikoku. Sau đó, Yoshiaki tìm kiếm và nhận được sự bảo trợ của gia tộc Mori ở phía Tây Nhật Bản. Sau đó, Toyotomi Hideyoshi yêu cầu Yoshiaki nhận ông làm con nuôi và Shogun Ashikaga thứ 16 nhưng ông từ chối.

Gia đình Ashikaga đã sống sót được sau thế kỷ 16, và một nhánh của nó trở thành một gia đình daimuo ở lãnh địa Kitsuregawa.[1]